HRM技术在植物育种中的应用

    HRM(High Resolution Melting，高分辨率溶解曲线)，作为上成熟的点突变扫描与检测技术，在人类疾病相关基因鉴定、植物诱变育种基因突变检测及基因分型等多个领域都得到了广泛的应用。现在我们就重点关注一下HRM技术在植物育种中的具体应用。

    现代农业技术领域中，分子遗传育种在植物育种中发挥着越来越大的作用。HRM之所以作为分子育种中常用的突变检测、基因分型技术，是由于HRM不受突变碱基位点和种类的局限，无需使用序列特异性探针，具有高灵敏度、操作简单、高通量、成本低等优点。

HRM在植物诱变群体中的突变扫描

    为了获得种质资源，常采用物理诱变、化学诱变等技术处理植物样本，而这些诱变技术通常会导致点突变、小片段插入缺失突变等。在获得诱变群体后，针对特定基因设计特异性引物，采用HRM技术高通量筛选诱变群体，获得突变个体。由于HRM技术速度快、成本低、通量高，所以非常适合植物诱变群体的点突变扫描。

    在异源六倍体小麦中，Dong等*次应用HRM分析EMS(Ethylmethane Sulfonate，甲基磺酸乙酯)诱发的点突变群体，实现同时扫描小麦SSII-A、SSII-B和SSII-D。他们在SSII-A、SSII-B和SSII-D的C末端保守区域上相似性很高的一段序列(532bp含17个SNPs)设计引物，分几个片段(长度约100～250bp)可同时扩增三个基因，然后对小麦农家种Ventura的EMS诱变群体进行HRM分析。对140个样品的未知突变进行扫描，片段ABD6-1由于其G+C含量高(63.72%)、固有的SNP较多(5 SNIPs)及二级结构造成的影响，有15个样品出现差异的熔解峰，结合其他手段进一步证实该群体扩增出的ABD6-1片段有8个突变体，而HRM分析扫描出其中的7个；片段ABD2-9中有6个突变体而HRM扫描出其中的5个；片段ABD12-22包含的6个突变体均被HRM扫描出。可见，HRM扫描未知突变的灵敏度较高(83.3%～100%)，且常受到G+C含量、二级结构、DNA样品纯度等因素的影响。

HRM在基因分型中的应用

    目前主流高通量SNP基因分型方法包括SNP芯片分型技术、KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）竞争性等位基因特异性PCR技术等，特别适合于需要筛选多个SNP位点且群体量大的样本群体。除此之外，HRM分析应该是仅次于以上两种高通量筛选技术的*选择。HRM分析应用于植物基因分型，不需要特异性序列探针，在PCR反应后直接对DNA双链逐渐升温变性熔解，然后通过光学检测系统采集荧光信号变化并绘制溶解曲线，软件会根据曲线准确将野生型、杂合型、纯合型样本区分开来。（如图）

      HRM实验的成功，除了周密的实验设计外，一款合适的仪器也是获得准确实验数据*的保证。根据HRM实验原理，对于仪器来讲，的温度均一性和高数据采集密度是保障实验成功的核心所在。由于点突变引起的解链温度差异很小，一般要求仪器的温度均一性小于0.2度才能检测出突变引起的温度差异，所以仪器的温度均一性越好，仪器的检测灵敏度就会越高。此外，仪器需要具备高的数据采集密度，才能实时地记录整个过程的温度变化。

    瑞士Roche LightCycler 480Ⅱ推出的实时荧光定量PCR系统，以其的性能深受广大科研工作者的青睐。对于HRM实验，LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR系统除了具备以上两点要求外，zui大的优点在于速度非常快且操作简便，专业的软件分析功能更有助于突变个体的鉴别，支持一键数据导出，方便实用，是实验室HRM实验的*选择！