常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
———文章转自zjubell， 发表在丁香园免疫学技术论坛。

（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联
1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）
偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐（mixed acid anhydride）,然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法
1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液（pH7.5）平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%（w/v）的缓冲液中。

2、碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤
1、  取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）
2、  取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解（II液）
3、  取血蓝蛋白（lemocyanin） 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）
4、  将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）
5、  室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液
6、  4度搅拌12小时
7、  静置10小时（4度）
8、  有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。

3、孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法
1、  用二垩烷（dioxane）溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
2、  加羟琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide） 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
3、  用簿层扫描方法纯化（氯仿：水=9：1）
4、  按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。
5、  
（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
1、芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤
1、  用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。
2、  滴加1％NaNO2（过量），4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离HNO2可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
3、  溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
4、  用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
5、  边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
6、  冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。
7、  用PBS透析2天
8、  -20度保存（浓度为20mg/mL）

双功能的酰亚胺酯（imidate esters）可以氨基反应，形成脒。例如：用二甲基已二酰亚胺酯（dimethyladipimide）将去甲基三正喋呤（desmethylmortriptyline）与β-半乳糖苷酶偶联。
2、、应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤
1、  用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯（dimethyladipimide）（A液）
2、  取与β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L 0.1ml（B液）
3、  将A液倒入B液。
4、  20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液（50m mol/L） 1ml, 终止反应。
5、  过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤（demethylmortriptyline ）进行偶联，则只有15％的酶与之结合。

（三）含巯基半抗原的偶联
可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺（bromoacetamide）激活。或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。

（四）含羟基的半抗原偶联
醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤
1、  15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐（succinic anhydride）和8.7ml 三乙基胺（triethylamime）用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、  加热回流1小时。
3、  减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、  用Ether洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到2.0）.
5、  用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）
6、  取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯（thionyl chloride）中，65度加热30分钟。
7、  减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。
8、  将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺（N,N-dimethylethylacetamide）中，室温搅拌反应2小时。
9、  65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。

半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤
1、  20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。
2、  加1滴乙二醇（得A液）
3、  将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至9.0）中
4、  4度反应2小时，期间不断调节pH9.0
5、  加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。 4度反应过夜。
6、  用含有MgCl2 10m mol/L,2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L、 NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）透析（更换透析液数次）

（五）含酮基或酮基半抗原的偶联
是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺
酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤
1、  在200ml 乙醇中，加入O-（羧甲基）羟胺 （O-（carboxyl）hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L
2、  加热回流90分钟
3、  旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用ether抽提
4、  用水洗涤ether抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。

（六）、其他半抗原的偶联
虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直接用来与载体蛋白 偶联。
制备雌二醇-6-肟的操作步骤
a、  雌二醇二醋酸盐的制备
1、  1g雌二醇溶于14ml 吡啶及3.5ml 醋酐中
2、  加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。
3、  收集白色晶体，得产物约1.1g（熔点126到127度）
b、  雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备
4、雌二醇二醋酸盐1.1g，滴加冰醋酸3.8ml 溶解后加含0.93g CrO3的含水冰醋酸6.35ml （H2O:Hac=0.75:5.6）
5、室温搅拌1小时，静置24小时
6、用水稀释，用ether提取4次
7、用蒸馏水洗2次
8、减压蒸馏，得结晶油状渣物。
9、用90度烘干20分钟，得粗制品约500mg
10、用11ml 无水乙醇溶解粗制品，再加1.1ml 冰醋酸及1.5g吉纳你特T试剂（Girad T），回流1小时。
11、冷却后，用冰致冷的蒸馏水稀释，用2.5mol/LNaOH调节pH至6.0-6.2.
12、用ether抽提3次，弃去ether。
13、水层用浓盐酸酸化（盐酸终浓度为1mol/L）.
14、室温静置2小时。
15、用ether抽提3次。
16、合并ether抽提液，用0.125mol/L碳酸钠溶液洗1次，用蒸馏水洗3次。
17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。
18、加7ml 醋酐，回流20分钟。
19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约176mg （熔点为162-166度）
c、  二醇-6-酮的制备
20、用5.5ml 20％的氢氧化钾-甲醇溶液（W/V）溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐（176mg）,在室温下于氮气中水解24小时。
21、加蒸馏水稀释，用ether抽提3次。
22、在ether提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg（熔点为278-282度）
d、  雌二醇-6-肟的制备
23、取雌二醇-6-酮 50mg ,盐酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇（V/V）7ml 和1mol/L醋酸钠4ml中，回流1.5小时。
24、减压、蒸馏、浓缩后，加蒸馏水20ml
25、用2 mol/L NaOH调节pH至8.5。
26、用醋酸乙酯抽提4次
27、水层用1 mol/L盐酸酸化至pH2.5。
28、用醋酸乙酯抽提4次
29、合并抽提液，蒸干，得产物约100mg（结晶熔点约186-188度）

其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。